Фізико-хімічні властивості білків

Форма білкової молекули. Дослідження нативної конформації білкових молекул показали, що ці частинки здебільшого мають більш менш асиметричну форму. Залежно від ступеня асиметрії, тобто співвідношення між довгою (b) і короткою (а) осями білкової молекули розрізняють глобулярні (кулясті) і фібрилярні (ниткоподібні) білки.

Глобулярними є білкові молекули, у яких згортання поліпептидних ланцюжків спричинило утворення сферичної структури. Серед них зустрічаються суворо кулясті, еліпсоподібні та паличкоподібні. Вони різняться за рівнем асиметрії. Наприклад, яєчний альбумін має b/а = 3, гліадин пшениці – 11, а зеїн кукурудзи – 20. Багато білків у живій природі є глобулярними.

Фібрилярні білки утворюють довгі високоасиметричні нитки. Багато хто з них виконує структурну або механічну функцію. Такі колаген (b/а - 200), кератини, фіброїн.

Білкам кожної із груп притаманні свої характерні властивості. Багато глобулярних білків розчиняються у воді і розведених сольових розчинах. Розчинним фібрилярним білкам властиві дуже в'язкі розчини. Глобулярні білки, як правило, мають хорошу біологічну цінність - засвоюються в процесі травлення, тоді як багато фібрилярних білків - немає.

Між глобулярними та фібрилярними білками відсутня чітка межа. Ряд білків займає проміжне положення та поєднує в собі ознаки як глобулярних, так і фібрилярних. До таких білків відносяться, наприклад, міозин м'язів (b/а = 75) та фібриноген крові (b/а = 18).Міозин має паличкоподібну форму, подібну до форми фібрилярних білків, проте, подібно до глобулярних білків, він розчинний у сольових розчинах. Розчини міозину та фібриногену в'язкі. Ці білки засвоюються у процесі травлення. У той самий час актин — глобулярний білок м'язів — не засвоюється.

Денатурація білка. Нативна конформація білкових молекул не є жорсткою, вона досить лабільна (лат. "Labilis" - ковзний) і при низці впливів може серйозно порушуватися. Порушення нативної конформації білка, що супроводжується зміною його нативних властивостей без розриву пептидних зв'язків, називається денатурацією (лат. Denaturare - позбавляти природних властивостей) білка.

Денатурація білків може бути викликана різними причинами, що призводять до порушення слабких взаємодій, а також до розриву дисульфідних зв'язків, що стабілізують їх нативну структуру.

Нагрівання більшості білків до температури вище 50°С, а також ультрафіолетове та інші види високоенергетичного опромінення посилюють коливання атомів поліпептидного ланцюга, що призводить до порушення різних зв'язків. Денатурацію білка здатне викликати навіть механічне струшування.

Денатурація білків також відбувається внаслідок хімічної дії. Сильні кислоти або луги впливають на іонізацію кислотних та основних груп, викликаючи порушення іонних та деяких водневих зв'язків у молекулах білків. Сечовина (H₂N-CO-NH₂) та органічні розчинники - спирти, феноли та ін. - Порушують систему водневих зв'язків і послаблюють у білкових молекулах гідрофобні взаємодії (сечовина - за рахунок порушення структури води, органічні розчинники - внаслідок встановлення контактів з неполярними радикалами амінокислот).Меркаптоетанол руйнує в білках дисульфідні зв'язки. Іони важких металів порушують слабкі взаємодії.

При денатурації відбувається зміна властивостей білка і насамперед зменшення його розчинності. Наприклад, при кип'ятінні білки коагулюють і випадають з розчинів осад у вигляді згустків (як при варінні курячого яйця). Осадження білків із розчинів відбувається також під впливом білкових осадників, як яких застосовують трихлороцтову кислоту, реактив Барнштейна (суміш гідроксиду натрію з сульфатом міді), розчин танніну та ін.

При денатурації зменшується водопоглинальна здатність білка, тобто його здатність до набухання; можуть з'являтися нові хімічні групи, наприклад: при впливі заходів каптоетанолу - SH-групи. Внаслідок денатурації білок втрачає свою біологічну активність.

Хоча первинна структура білка при денатурації не порушується, зміни є необоротними. Однак, наприклад, при поступовому видаленні сечовини методом діалізу з розчину денатурованого білка відбувається його ренатурація: нативна структура білка відновлюється, а разом з нею тією чи іншою мірою — і його нативні властивості. Така денатурація називається оборотною.

Необоротна денатурація білків відбувається у процесі старіння організмів. Тому, наприклад, насіння рослин, навіть за оптимальних умов зберігання, поступово втрачає свою схожість.

Денатурація білків має місце при випіканні хліба, сушінні макаронів, овочів, в ході приготування їжі і т. д. В результаті підвищується біологічна цінність цих білків, так як у процесі травлення легше засвоюються денатуровані (частково зруйновані) білки.

Ізоелектрична точка білка. У білках містяться різні основні та кислотні групи, які мають здатність до іонізації. У сильнокислому середовищі активно протонуються основні угруповання (аміногрупи та інших.), і молекули білка набувають сумарний позитивний заряд, а сильнощелочной середовищі — легко дисоціюють карбоксильні групи, і молекули білка набувають сумарний негативний заряд.

Джерелами позитивного заряду в білках виступають бічні радикали залишків лізину, аргініну та гістидину, а-аміногрупа залишку N-кінцевої амінокислоти. Джерела негативного заряду - бічні радикали залишків аспарагінової та глутамінової кислот, а-карбоксильна група залишку С-кінцевої амінокислоти.

При певному значенні рН середовища спостерігається рівність позитивних і негативних зарядів лежить на поверхні білкової молекули, т. е. її сумарний електричний заряд виявляється рівним нулю. Таке значення рН розчину, у якому молекула білка електронейтральна, називають изоэлектрической точкою білка (pi).

Ізоелектричні точки є характерними константами білків. Вони визначаються їх амінокислотним складом і структурою: кількістю та розташуванням залишків кислих та основних амінокислот у поліпептидних ланцюгах. Ізоелектричні точки білків, у яких переважають залишки кислих амінокислот, розташовуються в ділянці рН7. Ізоелектричні точки більшості білків перебувають у слабокислому середовищі.

У ізоелектричному стані розчини білків мають мінімальну в'язкість. Це з зміною форми білкової молекули. У изоэлектрической точці різноіменно заряджені групи притягуються друг до друга, і білки закручуються клубки.При зміщенні рН від ізоелектричної точки однойменно заряджені групи відштовхуються, молекули білка розгортаються. У розгорнутому стані білкові молекули надають розчинам вищу в'язкість, ніж згорнуті клубки.

В ізоелектричній точці білки мають мінімальну розчинність і можуть легко випадати в осад.

Однак осадження білків в ізоелектричній точці все ж таки не відбувається. Цьому перешкоджають структуровані молекули води, що утримують на поверхні білкових глобул значну частину амінокислотних гідрофобних радикалів.

Облогити білки можна за допомогою органічних розчинників (спирту, ацетону), що порушують систему гідрофобних контактів у молекулах білка, а також високих концентрацій солей (методом висолювання), що зменшують гідратацію білкових глобул. В останньому випадку частина води йде на розчинення солі та перестає брати участь у розчиненні білка. Такий розчин за нестачею розчинника стає пересиченим, що спричиняє випадання частини його в осад. Білкові молекули починають злипатися і, утворюючи дедалі більші частинки, поступово осідати з розчину.

Оптичні властивості білка. Розчини білків мають оптичну активність, тобто здатність обертати площину поляризації світла. Ця властивість білків обумовлена ​​наявністю в їх молекулах елементів асиметрії - асиметричних атомів вуглецю та правозакрученої аспіралі.

При денатурації білка відбувається зміна його оптичних властивостей, що з руйнацією а-спирали. Оптичні властивості повністю денатурованих білків залежить тільки від наявності у яких асиметричних атомів вуглецю.

За різницею у прояві білком оптичних властивостей до та після денатурації можна визначити ступінь його спіралізації.

Якісні реакції на білки. Для білків характерні кольорові реакції, зумовлені наявністю у яких тих чи інших хімічних угруповань. Ці реакції часто використовуються виявлення білків.

При додаванні до білкового розчину сульфату міді та лугу з'являється бузкове фарбування, пов'язане з утворенням комплексів іонів міді з пептидними групами білка. Оскільки цю реакцію дає біурет (H₂N-CO-NH-CO-NH₂), вона отримала назву біуретової. Її часто використовують для кількісного визначення білка, поряд з методом І. К'єльдаля, так як інтенсивність забарвлення, що виникає, пропорційна концентрації білка в розчині.

При нагріванні розчинів білків з концентрованою азотною кислотою з'являється жовте фарбування, зумовлене утворенням ароматичних нітропохідних амінокислот. Цю реакцію називають ксантопротеїновою (грец. «ксантос» - жовтий).

Багато білкових розчинів при нагріванні вступають у реакцію з азотнокислим розчином ртуті, яка утворює з фенолами та їх похідними комплексні сполуки малинового кольору. Це якісна реакція Міллона на тирозин.

В результаті нагрівання більшості білкових розчинів з оцтовокислим свинцем у лужному середовищі випадає чорний осад сульфіду свинцю. Дана реакція використовується для виявлення сірковмісних амінокислот і називається реакцією Фолю.

• Амінокислотний склад білків
• Фізичні та фізико-хімічні властивості яєць
• Хімічні та фізико-хімічні зміни у продуктах при копченні
• Фізичні та фізико-хімічні властивості клейковини
• Фізико-хімічні властивості сапропелів
• Фізико-хімічні властивості вірусу ринопневмонії
• Хімічні властивості клейковини
• Класифікація білків
• Основні біологічні функції білків
• Основні хімічні компоненти пшениці та борошна

БІОХІМІЯ ПІДРУЧНИК ДЛЯ ВНЗ - Є. С. Северина - 2004

Важливе місце у біохімічних дослідженнях займає виділення індивідуальних білків із органів та тканин. Очищені індивідуальні білки потрібні для вивчення їх первинної структури, отримання кристалів білків з метою дослідження їхньої просторової структури методом рентгеноструктурного аналізу, встановлення взаємозв'язку між первинною, просторовою структурою білка та його функцією.

Деякі очищені індивідуальні білки використовують у медицині як лікарські препарати, наприклад, гормон інсулін застосовують для лікування цукрового діабету, а травні ферменти підшлункової залози призначають при порушенні її функцій як замісну терапію. Крім того, очищені ферменти часто використовують у біохімічних дослідженнях як хімічні реактиви для визначення речовин у біологічних рідинах.

Більшість методів, що використовуються для очищення індивідуальних білків, ґрунтуються на відмінностях їх фізико-хімічних властивостей, а також можливості специфічно зв'язуватися з лігандом.

А. Фізико-хімічні властивості білків

Індивідуальні білки розрізняються за своїми фізико-хімічними властивостями: формою молекул, молекулярною масою, сумарним зарядом молекули, співвідношенням полярних і неполярних груп на поверхні нативної молекули білка, розчинності білків, а також ступеня стійкості до дії агентів, що денатурують.

1. Відмінності білків формою молекул

Як уже говорилося вище, по _формі молекул білки ділять на глобулярні та фібрилярні. Глобулярні білки мають компактнішу структуру, їх гідрофобні радикали здебільшого заховані в гідрофобне ядро, і вони значно краще розчиняються в рідинах організму, ніж фібрилярні білки (виняток становлять мембранні білки).

2. Відмінності білків за молекулярною масою

Білки є високомолекулярними сполуками, але можуть сильно відрізнятися за молекулярною масою, яка коливається від 6000 до 1 000 000 Д і вище. Молекулярна маса білка залежить від кількості амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюгу, а для олігомерних білків — і від кількості протомерів, що входять до нього (або субодиниць).

3. Сумарний заряд білків

Білки мають у своєму складі радикали лізину, аргініну, гістидину, глутамінової та аспарагінової кислот, що містять функціональні групи, здатні до іонізації (іоногенні групи). Крім того, на N- і С-кінцях поліпептидних ланцюгів є -аміно- і -карбоксильна групи, також здатні до іонізації. Сумарний заряд білкової молекули залежить від співвідношення іонізованих аніонних радикалів Глу та Асп та катіонних радикалів Ліз, Apг та Гіс.

Ступінь іонізації функціональних груп цих радикалів залежить від pH середовища. При pH розчину близько 7, всі іоногенні групи білка знаходяться в іонізованому стані. У кислому середовищі збільшення концентрації протонів (Н + ) призводить до придушення дисоціації карбоксильних груп та зменшення негативного заряду білків: -СОО - + Н + -> -СООН. У лужному середовищі зв'язування надлишку ВІН - з протонами, що утворюються при дисоціації NH₃ + з утворенням води, що призводить до зменшення позитивного заряду білків:

Значення pH, при якому білок набуває сумарного нульового заряду, називають «Ізоелектрична точка» та позначають як pI. У изоэлектрической точці кількість позитивно і негативно заряджених груп білка однаково, т. е. білок перебуває у изоэлектрическом стані.

Так як більшість білків у клітині має у своєму складі більше аніоногенних груп (-СОО - ), то ізоелектрична точка цих білків лежить у слабокислому середовищі. Ізоелектрична точка білків, у складі яких переважають катіоногенні групи, знаходиться в лужному середовищі. Найбільш яскравий приклад таких внутрішньоклітинних білків, що містять багато аргініну та лізину, - гістони, що входять до складу хроматину.

Білки, що мають сумарний позитивний або негативний заряд, краще розчиняються, ніж білки, що знаходяться в точці ізоелектрики. Сумарний заряд збільшує кількість диполів води, здатних зв'язуватися з білковою молекулою, і перешкоджає контакту однойменно заряджених молекул, в результаті збільшується розчинність білків. Заряджені білки можуть рухатися в електричному полі: аніонні білки, що мають негативний заряд, рухатимуться до позитивно зарядженого анода (+), а катіонні білки - до негативно зарядженого катода (-). Білки, які перебувають у ізоелектричному стані, не переміщуються в електричному полі.

4. Співвідношення полярних та неполярних груп на поверхні нативних молекул білків

На поверхні більшості внутрішньоклітинних білків переважають полярні радикали, проте співвідношення полярних і неполярних груп добре для різних індивідуальних білків. Так, протомери олігомерних білків у сфері контактів один з одним часто містять гідрофобні радикали.Поверхні білків, що функціонують у складі мембран або прикріплюються до них у процесі функціонування, також збагачені гідрофобними радикалами. Такі білки краще розчиняються у ліпідах, ніж у воді.

5. Розчинність білків

Розчинність білків у воді залежить від усіх перерахованих вище властивостей білків: форми, молекулярної маси, величини заряду, співвідношення полярних та неполярних функціональних груп на поверхні білка. З іншого боку, розчинність білка визначається складом розчинника, тобто. наявністю у розчині інших розчинених речовин. Наприклад, деякі білки легше розчиняються у слабкому сольовому розчині, ніж у дистильованій воді. З іншого боку, збільшення концентрації нейтральних солей може сприяти випаданню певних білків в осад. Денатурують агенти, присутні в розчині, також знижують розчинність білків.

Б. Методи виділення та очищення білків

Отримання індивідуальних білків із біологічного матеріалу (тканин, органів, клітинних культур) вимагає проведення послідовних операцій, що включають:

✵ дроблення біологічного матеріалу та руйнування клітинних мембран;

✵ фракціонування органел, що містять ті чи інші білки;

✵ екстракцію білків (переведення їх у розчинений стан);

✵ поділ суміші білків на індивідуальні білки.

1. Методи руйнування тканин та екстракції білків

Для руйнування біологічного матеріалу використовують методи: гомогенізації тканини, метод поперемінного заморожування та розморожування, а також обробку клітин ультразвуком.

Гомогенізація біологічного матеріалу

Тканина, що знаходиться в буферному розчині з певним значенням pH і концентрацією солей, поміщають у скляну посудину (гомогенізатор) з маточкою.Пелік, що обертається, подрібнює і розтирає тканину про притерті стінки судини.

Метод заморожування та відтавання тканини

В результаті поперемінного заморожування і відтавання кристали льоду, що утворюються, руйнують оболонки клітин.

Після руйнування тканини нерозчинні частини беруть в облогу центрифугуванням. Подальше центрифугування гомогенату з різною швидкістю дозволяє отримати окремі фракції, що містять клітинні ядра, мітохондрії та інші органели, а також надосадову рідину, в якій знаходяться розчинні білки цитозолю клітини. Білок, що шукається, утримуватиметься в одній із цих фракцій.

Екстракція білків, пов'язаних з мембранами, та руйнування олігомерних білків на протоміри

Якщо білок, що шукається, міцно пов'язаний з будь-якими структурами клітини, його необхідно перевести в розчин. Так, для руйнування гідрофобних взаємодій між білками та ліпідами мембран розчин додають детергенти; найчастіше використовують тритон Х-100 чи додецилсульфат натрію.

Механізм дії детергентів описаний розділ «Денатурація білків» (див. рис. 1-15). При дії детергентів зазвичай руйнуються гідрофобні взаємодії між протомерами в олігомерних білках.

Видалення з розчину небілкових речовин

Нуклеїнові кислоти, ліпіди та інші небілкові речовини можна видалити з розчину, використовуючи їх особливі фізико-хімічні властивості. Так, ліпіди легко видаляються з розчину додаванням органічних розчинників, наприклад, ацетону. Проте вплив має бути короткочасним, оскільки ацетон викликає денатурацію деяких білків. Нуклеїнові кислоти беруть в облогу додаванням в розчин стрептоміцину.

2. Методи очищення білків

Найбільш трудомісткий етап отримання індивідуальних білків - їх очищення з інших білків, що у розчині, отриманому з цієї тканини. Білок, що часто вивчається, присутній у невеликих кількостях, що становлять частки відсотка від усіх білків розчину.

Так як білки мають конформаційну лабільність, при роботі з білками слід уникати денатуруючих впливів, тому виділення та очищення білків відбуваються при низьких температурах.

На перших стадіях очищення білків доцільно використовувати методи, що враховують будь-яку характерну особливість даного білка, наприклад термостабільність або стійкість в кислих розчинах. Першими методами очищення необхідно видалити з розчину основну масу баластових білків, які значно відрізняються від білка, що виділяється фізико-хімічними властивостями. Згодом застосовують дедалі тонші методи очищення білка.

Очищення білків виборчою денатурацією

Більшість білків денатурує і випадає в осад вже при короткочасному нагріванні розчину до 50 - 70 ° С або підкисленні розчину до pH 5. Якщо виділений білок витримує ці умови, то за допомогою виборчої денатурації можна видалити більшу частину сторонніх білків, відфільтрувавши білки, що випали в осад, або осадити їх центрифугуванням.

Метод очищення білків, заснований на відмінностях у їхній розчинності при різній концентрації солі в розчині. Солі лужних і лужноземельних металів викликають оборотне осадження білків, тобто. після їх видалення білки знову набувають здатності розчинятися, зберігаючи при цьому свої нативні властивості.

Найчастіше для поділу білків методом висолювання використовують різні концентрації солей сульфату амонію - (NН₄)₂SO₄. Чим вище розчинність білка, тим більша концентрація солі необхідна його висолювання.

Гель-фільтрація, або метод молекулярних сит

Для поділу білків часто використовують хроматографічні методи, що базуються на розподілі речовин між двома фазами, одна з яких рухлива, а інша нерухома. В основу хроматографічних методів покладено різні принципи: гель-фільтрацію, іонний обмін, адсорбцію, біологічну спорідненість.

Метод поділу білків за допомогою гель-фільтраційної хроматографії заснований на тому, що речовини, що відрізняються молекулярною масою, по-різному розподіляються між нерухомою та рухомою фазами. Хроматографічна колонка заповнюється гранулами пористої речовини (сефадекс, агароз та ін). У структурі полісахариду утворюються поперечні зв'язки та формуються гранули з «порами», через які легко проходять вода та низькомолекулярні речовини. Залежно та умовами можна формувати гранули з різною величиною «пор».

Нерухома фаза - рідина всередині гранул, в яку здатні проникати низькомолекулярні речовини та білки з невеликою молекулярною масою. Суміш білків, нанесену на хроматографічну колонку, вимивають (елююють), пропускаючи через колонку розчинник. Разом із фронтом розчинника рухаються й найбільші молекули.

Дрібніші молекули дифундують всередину гранул сефадекса і на деякий час потрапляють у нерухому фазу, внаслідок чого їхній рух затримується. Величина пір визначає розмір молекул, здатних проникати всередину гранул (рис. 1-55).

Мал. 1-55. Поділ суміші білків методом гель-фільтрації.

Так як гелева структура сефадекс легко деформується під тиском, гелі стали замінювати більш жорсткими матрицями (сефактил, той-оперл), що представляють сферичні гранули з різними розмірами пор. Вибір розмірів пор у гранулах залежить від цілей хроматографії (про інші хроматографічні методи буде сказано нижче).

Метод поділу також ґрунтується на відмінності в молекулярних масах білків. Швидкість седиментації речовин у процесі обертання в ультрацентрифузі, де відцентрове прискорення досягає 100 000 - 500 000 g, пропорційно їхній молекулярній масі. На поверхню буферного розчину, вміщеного в кювету, наносять тонкий шар суміші білків. Кювету поміщають у ротор ультрацентрифуги. При обертанні ротора протягом 10 - 12 год більші молекули (з більшою молекулярною масою) осідають у буферному розчині з більшою швидкістю. У результаті кюветі відбувається розшарування суміші білків на окремі фракції з різною молекулярною масою (рис. 1-56). Після розшарування білкових фракцій дно кювети проколюють голкою і краплями збирають вміст невеликими порціями в пробірки.

Мал. 1-56. Кювета заповнена буферним розчином з розділеними білковими фракціями.

Метод заснований на тому, що при певному значенні pH та іонної сили розчину білки рухаються в електричному полі зі швидкістю, пропорційною їх сумарному заряду. Білки, які мають сумарний негативний заряд, рухаються до анода (+), а позитивно заряджені білки - до катода (-).

Електрофорез проводять на різних носіях: папері, крохмальному гелі, поліакриламідному гелі та ін.На відміну від електрофорезу на папері, де швидкість руху білків пропорційна лише їх сумарному заряду, в поліакриламідному гелі швидкість руху білків пропорційна їх молекулярним масам.

Роздільна здатність електрофорезу в поліакриламідному гелі вища, ніж на папері. Так, при електрофорезі білків сироватки крові людини на папері виявляють лише 5 головних фракцій: альбуміни, α₁-глобуліни, α₂-глобуліни, β-глобуліни та y-глобуліни (рис. 1-57). Електрофорез тих же білків у поліакриламідному гелі дозволяє одержати до 18 різних фракцій. Для виявлення білкових фракцій смужки паперу чи стовпчики гелю обробляють барвником (найчастіше бромфеноловим синім чи амідовим чорним). Забарвлений комплекс білків з барвником виявляє розташування різних фракцій на носії.

Мал. 1-57. Електрофорез білків сироватки крові здорової людини на папері.

Так само, як і електрофорез, метод заснований на поділі білків, що відрізняються сумарним зарядом при певних значеннях рн та іонної сили розчину. При пропущенні розчину білків через хроматографічну колонку, заповнену пористим твердим зарядженим матеріалом, частина білків затримується на ньому в результаті електростатичних взаємодій.

Як нерухому фазу використовують іонообмінники - полімерні органічні речовини, що містять заряджені функціональні групи.

Розрізняють позитивно заряджені аніонообмінники, серед яких найбільш часто використовують діетиламіноетилцелюлозу (ДЕАЕ-целюлозу), що містить катіонні групи, і негативно заряджені катіонообмінники, наприклад, карбоксиметилцелюлозу (КМ-целюлозу), що містить аніонні групи.

Вибір іонообмінника визначається зарядом білка, що виділяється. Так, виділення негативно зарядженого білка використовують аніонообмінник. При пропусканні розчину білка через колонку міцність зв'язування білка з аніонообмінником залежить кількості негативно заряджених карбоксильних груп у молекулі. Білки, адсорбовані на аніонообміннику, можна змити (елюювати) буферними розчинами з різною концентрацією солі, найчастіше NaCl, та різними значеннями pH. Іони хлору зв'язуються з позитивно зарядженими функціональними групами аніонообмінника та витісняють карбоксильні групи білків. При низьких концентраціях солі елююються білки, що слабко пов'язані з аніонообмінником. Поступове збільшення концентрації солі або зміна pH, що змінює заряд білкової молекули, призводить до виділення білкових фракцій, в одній з яких знаходиться білок, що шукається.

Афінна хроматографія, або хроматографія за спорідненістю

Це найбільш специфічний метод виділення індивідуальних білків, що базується на виборчій взаємодії білків з лігандами, прикріпленими (іммобілізованими) до твердого носія. Як ліганд може бути використаний субстрат або кофермент, якщо виділяють якийсь фермент, антигени для виділення антитіл і т. д. Через колонку, заповнену іммобілізованим лігандом, пропускають розчин, що містить суміш білків. До ліганду приєднується лише білок, що специфічно взаємодіє з ним; решта білків виходять з елюатом (рис. 1-58). Білок, адсорбований на колонці, можна зняти, промивши її розчином із зміненим значенням pH або зміненою іонною силою.У деяких випадках використовують розчин детергенту, що розриває гідрофобні зв'язки між білком та лігандом.

Мал. 1-58. Афінна хроматографія.

Афінна хроматографія відрізняється високою вибірковістю і допомагає очистити білок, що виділяється в тисячі разів.

3. Очищення білків від низькомолекулярних домішок

Для видалення низькомолекулярних сполук, зокрема сульфату амонію після висолювання, застосовують діаліз. Метод ґрунтується на тому, що через напівпроникну мембрану, що пропускає низькомолекулярні речовини, не проходять білки, що мають більш високу молекулярну масу. У склянку великої ємності (близько 1 л) із буферним розчином поміщають напівпроникний мішечок, заповнений розчином білка із сіллю.

Швидкість виходу солі з мішечка в буферний розчин пропорційна градієнту його концентрацій з обох боків від мембрани. У міру виходу солі з мішечка буферний розчин у склянці змінюють.

Для очищення білків від низькомолекулярних домішок використовують метод гель-фільтрації (див. вище).

Для визначення частоти (гомогенності) виділеного білка застосовують методи з високою роздільною здатністю, наприклад, електрофорез у поліакриламідному гелі, високоефективна хроматографія високого тиску. Від чистоти лікарського білкового препарату залежать його біологічна ефективність та алергенність (тобто здатність викликати алергічні реакції). Чим якісніше очищений препарат, тим менша ймовірність ускладнень при його застосуванні.

Біологічна бібліотека – матеріали для студентів, вчителів, учнів та їх батьків.

Наш сайт не претендує на авторство розміщених матеріалів.Ми лише конвертуємо у зручний формат матеріали, які знаходяться у відкритому доступі та надіслані нашими відвідувачами.

Якщо ви володієте авторським правом на будь-який розміщений у нас матеріал і маєте намір видалити його або отримати посилання на місце комерційного розміщення матеріалів, зверніться для погодження до адміністратора сайту.

Дозволяється копіювати матеріали з обов'язковим гіпертекстовим посиланням на сайт, будьте вдячними ми витратили багато зусиль, щоб привести інформацію у зручний вигляд.