Сайленсери: цис-діючі компоненти у дріжджів
Тип спарювання у дріжджів визначається генами, присутніми в локусі МАТ, що експресується. Гени, що визначають тип парування дріжджів є і в двох інших сайтах - HML і HMR - на тій же хромосомі поблизу лівої та правої теломер. У цих сайтах гени типу спарювання, проте, не експресуються навіть за наявності всіх сигналів експресії [Laurenson, ea 1992]. Ця позиційно-залежна, але ген-незалежна репресія відома як сайленсинг у дріжджів. Вона поширюється і на дріжджові гени, якщо їх помістити в HML і HMR і обумовлена утворенням специфічної хроматинової структури, яка, мабуть, у дріжджів еквівалентна гетерохроматину багатоклітинних. Сайленсинг залежить від узгодженої дії цис-діючих послідовностей та декількох транс-діючих факторів, у тому числі продуктів генів SIR. Цис-діючі послідовності, фланкуючі HML і HMR відомі як E-сайленсери і I-сайленсери і складаються з консенсусних послідовностей для ДНК-зв'язувальних білків Raplp, Abflp і білків ORC (Origin Recognition Complex) [Kurtz, ea 199 , Loo, ea 1995, Loo, ea 1995]. Всі чотири сайленсери містять сайт, який відповідає 11 - нуклеотидному консенсусу, знайденому у всіх відомих послідовностей, що автономно реплікуються ( ARS ). Цей центральний елемент або ARS-консенсусна послідовність (ACS) потрібний для функціонування ориджину реплікації і є сайтом зв'язування комплексу шести поліпептидів ORC [ Bell, ea 1993 , Newlon, ea 1993 ].
Синтетичний сайленсер, що містить один сайт зв'язування для білків ORC, Raplp і Abflp, повністю активний в сайленсингу. Організація елементів зв'язування, характерна сайленсерів, не характерна для теломер. Тіломіри S.cerevisiae складаються з кінцевих повторів С1-3А різної довжини (~ 150-450 основ), приєднаних до більш довгого та складнішого набору Х- та Y'-елементів. Важлива риса полі(С1-3А)-послідовностей полягає в регулярному повторенні центрів зв'язування Raplp [Conrad, ea 1990]. Хоча короткі ділянки полі(С1-3А)-послідовності при локалізації у внутрішніх сайтах хромосоми недостатні для репресії [Gottschling, ea 1990], більш довгі послідовності функціонують як сайленсери [Stavenhaszcn, ea 1994]. Додаткові структурні елементи теломер також грають роль ТЕП. Репресія репортерного гена URA3 поширюється з теломери нативної хромосоми, що містить Y'- елемент далі, ніж у хромосомі без такої послідовності [Renauld, ea 1993]. Функція Х-елементів у ТЕП незрозуміла.
Присутність мовчазних локусів типу спарювання поблизу теломер хромосоми III призвело до думки, що це положення може відігравати роль у сайленсингу НМ [Gilson, ea 1993]. Справді, видалення локусів, що мовчать, від теломери послаблює їх властивості як сайленсерів [Shei, ea 1995, Thompson. ea 1994]. Використовуючи ген-репортер, фланкований повнорозмірними сайленсерами типу спарювання HML-E та HML-I, вбудований у різні сайти хромосом, Мейлетт із співавт. [Konkel, ea 1995] показав, що близькість до послідовностей тіломірних повторів необхідна для репресії цього гена. Репортерний ген не репресується за інтеграції на відстань більше 200 т.п.н. від теломери. Репресія відновлюється чи створенням нової теломери з відривом 13 т.п.н. від репортера, або вставкою теломерної послідовності довжиною 350 п.н., яка сама по собі недостатня для репресії транскрипції [Stavenhaszcn, ea 1994]. Сайленсери служать як сайти, що забезпечують складання гетерохроматину [Shei, ea 1995].Гіперпродукція PPR1, активатора транскрипції URA3, веде до ослаблення сайленсингу послідовності URA3, включеної в теломер [Aparicio, ea 1994]. Це пояснюється конкуренцією сайленсеру, що сприяє конденсації хроматину, та енхансеру або білка-активатора, що сприяє відкритій конфігурації хроматину.
Ще однією функцією сайленсерів є допомога у розміщенні певних локусів у специфічних для них суб'ядерних компартментах. Білок Rapl локалізується на периферії ядра [Klein, ea 1992], тоді як ARS-послідовності дріжджів переважно пов'язані з ядерним матриксом [Amati. ea 1988]. Генетичні дані дозволяють припустити, що для створення та підтримки репресованого стану хроматину навіть при його внутрішньохромосомній локалізації необхідна критична локальна концентрація білків Sir [Konkel, ea 1995, Stavenhaszcn, ea 1994, Lustig ea 1996,99,6.
Як працюють Сайленсери?
У цій роботі на підставі аналізу літературних джерел представлені узагальнені дані про пристрій та просторову організацію ДНК, рівні упаковки хроматину, а також відомості, що стосуються структури, функціонування та регулювання роботи генів у живих організмах. Дана коротка характеристика структурних та регуляторних генів. Відзначено важливість білка CTCF у просторовій конфігурації ДНК. Розглянуто сучасні уявлення про найважливіші регуляторні елементи геному, таких як промотори, енхансери, сайленсери та інсулятори, механізми їх дії та епігенетичну регуляцію. На підставі вже встановлених відомостей показано, як організація ДНК визначає активність генів, а також зазначено, що ДНК, що не кодує, впливає на їх експресію. Важливість регуляторних елементів геному продемонстрована з прикладу розвитку зародка Drosophila melanogaster.
1. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes малих RNAs з antisense complementarity to lin-14 //Cell. - 1993. - Т. 75. - № 5. - С. 843-854.
2. Orgel L.E., Crick F.H.C. Selfish DNA: ultimate parasite //Nature. - 1980. - Т. 284. - С. 604-607.
3. McClintock B. Controlling elements and the gene // Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1956. - Т. 21. - С. 197-216.
4. Buchon N., Vaury C. RNAi: Defensive RNA-silencing проти viruses і transposable elements // Heredity. - 2006. - Т. 96. - № 2. - С. 195-202.
5. Євгеньев М.Б. та ін. Мобільні елементи та еволюція геному // Молекулярна біологія. - 2007. - Т. 41. - № 2. - С. 234-245.
6. Kornberg R.D., Thonmas J.O. Chromatin structure: oligomers of the histones // Science. - 1974. - Т. 184. - № 4139. - С. 865-868.
7. Ілатовський А.В., Лебедєв Д.В., Філатов М.В., Пєтухов М.Г., Ісаєв-Іванов В.В. Сучасні ставлення до структурної організації хроматину // Цитологія. - 2012. - Т. 54. - № 4. - С. 298-306.
8. Golov A.K., Razin S.V., Gavrilov A.A. Nucleosomal packaging of eukaryotic DNA і регулювання transcription // Biopolymers and Cell. - 2014. - Т. 30. - № 6. - С. 413-425.
9. Разін С.В. Хроматин та регуляція транскрипції // Молекулярна біологія. - 2007. - Т. 41. - № 3. - С. 387-394.
10. Weintraub H., Groudine M. Chromosomal subunits в активних genes hav altered conformation //Science. - 1976. - Т. 193. - № 4256. - С. 848-856.
11. Cook P.R., Brazell I. A. Supercoils in human DNA // Journal of Cell Science. - 1975. - Т. 19. - № 2. - С. 261-279.
12. Sanborn A.L. та ін. Chromatin extrusion explains key features of loop and domain formation in wild-type and engineered genomes // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2015. - Т. 112. - № 47. - С. E6456-E6465.
13. Вечканов Є.М., Шкурат Т.П., Сорокіна І.А.Функції некодуючих ділянок молекули ДНК // Валеологія. - 2012. - № 3. - С. 133-137.
14. Савінкова Л.К. та ін. Взаємодія рекомбінантного ТАТА-зв'язуючого білка з тата-боксами промоторів генів ссавців // Ecological genetics. - 2007. - Т. 5. - № 2. - С. 44–49.
15. Разін С.В., Гаврилов А.А., Ульянов С.В. Регуляторні елементи еукаріотичного геному, що контролюють транскрипцію // Молек. біологія. - 2015. - Т. 49. - № 2. - С. 212–223.
16. Ponjavic J. та ін. Transcriptional and structural impact of TATA-initiation site spacing in mammalian core promoters // Genome biology. - 2006. - Т. 7. - № 8-R78. - С. 1–18.
17. Соболева Т.А. та ін. Histone variants at transcription start-site // Trends in Genetics. - 2014. - Т. 30. - № 5. - С. 199-209.
18. Symmons O. та ін. Функціональні і топологічні характеристики мамалійської регулювальної системи domains // Genome research. - 2014. - Т. 24. - № 3. - С. 390-400.
19. Heintzman N.D. та ін. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression // Nature. - 2009. - Т. 459. - № 7243. - С. 108-112.
20. Boettiger A. N., Ralph P. L., Evans S. N. Transcriptional regulation: ефекти прототипу proximal pausing on speed, synchrony and reliability //PLoS Comput Biol. - 2011. - Т. 7. - № 5. - С. e1001136.
21. Kim T.K. та ін. Швидкийперехід на neuronal activity-regulated enhancers // Nature. - 2010. - Т. 465. - № 7295. - С. 182-187.
22. Melo C.A. та ін. eRNAs є необхідним для p53-dependent активність діяльності і гене transcription // Molecular cell. - 2013. - Т. 49. - № 3. - С. 524-535.
23. de Laat W., Grosveld F. patial organization of gene expression: the active chromatin hub // Chromosome Research. - 2003. - Т. 11. - № 5. - С. 447-459.
24. Гаврілов А.А. та ін.Dynamic nature of active chromatin hubs // Biopolym. Cell.-2011.-27. - 2011. - № 5. - С. 364-368.
25. Phillips J.E., Corces V.G. CTCF: master weaver of the genome //Cell. - 2009. - Т. 137. - № 7. - С. 1194-1211.
26. Schwartz Y.B. та ін. Genome-wide analysis of Polycomb targets в Drosophila melanogaster // Nature genetics. - 2006. - Т. 38. - № 6. - С. 700-705.
27. McCall K., Bender W. Probes of chromatin accessibility в drosophila bithorax complex відповідає відмінно до Polycomb-mediated repression // The EMBO Journal. - 1996. - Т. 15. - № 3. - С. 569-580.
28. Boivin A., Dura J. M. In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila // Genetics. - 1998. - Т. 150. - № 4. - С. 1539-1549.
29. Fitzgerald D.P., Bender W. Polycomb group repression reduces DNA accessibility // Molecular і cellular biology. - 2001. - Т. 21. - № 19. - С. 6585-6597.
30. Kondo T. та ін. Polycomb potentiates meis2 activation в midbrain за допомогою mediating interaction of promoter with tissue-specific enhancer // Developmental cell. - 2014. - Т. 28. - № 1. - С. 94–101.
31. Merkenschlager M., Odom D. T. CTCF і cohesin: linking gene regulatory elements with their targets // Cell. - 2013. - Т. 152. - № 6. - С. 1285-1297.
32. Ingham P.W. Molecular genetics embryonic pattern formation в Drosophila // Nature. - 1988. - Т. 335. - № 6185. - С. 25–34.
33. Hoch M., Jäckle H. Transcriptional regulation and spatic patterning in Drosophila // Current opinion in genetics & development. - 1993. - Т. 3. - № 4. - С. 566-573.
34. Kornberg Т.Б., Tabata T. Segmentation of the Drosophila embryo // Current opinion in genetics & development. - 1993. - Т. 3. - № 4. - С. 585-593.
35. DiNardo S. та ін.Making of a maggot: patterning the Drosophila embryonic epidermis // Current opinion in genetics & development. – 1994. – Т. 4. – № 4. – З.
36. Paro R. Imprinting determined state in the chromatin of Drosophila // Trends in Genetics. – Т. 6. – С. 416–421.
37. Kennison J.A.
38. Simon J. Locking в статевих державах ген генетики: transcriptional control під час Drosophila development // Current opinion in cell biology. – 1995.
39. Pirrotta V. Chromatin-silencing mechanisms in Drosophila maintain patterns of gene expression // Trends in Genetics. – Т. 13. – № 8. – С. 314–318.
40. Maeda R.K., Karch F. ABC of BX-C: bithorax complex explained // Development. – 2006. – Т. 133. – № 8. – С. 1413–1422.
41. Паткін Е.Л., Квін Д. Епігенетичні механізми схильності до комплексних патологій людини // Ecological genetics. – 2010. – Т. 8. – № 4. – С. 44–56.
42. Fischer J.J. та інші.
43. Redon C. et al.
44. Klose R.J., Bird A.P.
45. Weinberg M.S., Wood M.J. A. Short non-coding RNA biology and neurodegenerative disorders: novel disease targets and therapeutics //Human molecular genetics. – Т. 18. – № R1.
48.Cavalli G., Paro R. Chromo-domain proteins: linking chromatin structure to epigenetic regulation // Current opinion in cell biology. - 1998. - Т. 10. - № 3. - С. 354-360.
49. Dalgaard K. та ін. Trim28 haploinsufficiency triggers bi-stable epigenetic obesity // Cell. – 2016. – Т. 164. – № 3. – С. 353–364.
50. Sen P. та ін. Епігенетичні mechanisms of longevity and aging // Cell. - 2016. - Т. 166. - № 4. - С. 822-839.
Існують моделі, припущення та теорії, що стосуються організації та діяльності геному. Проте точні механізми взаємодії окремих елементів залишаються досі остаточно не з'ясованими. У зв'язку з цим велике значення має поєднана характеристика наявних відомостей про функціонування геному. Враховуючи значний обсяг проведених досліджень, пропонуємо узагальнені дані про організацію та діяльність генів, робота яких залежить від просторового укладання ДНК, структури та впливу регуляторних елементів геному, а також епігенетичних факторів.
За функціональними особливостями виділяють дві групи генів: структурні та регуляторні. Регуляторними називають гени, діяльність яких впливає експресію інших генів – структурних. Отже, білкові продукти структурних генів виявляються свого роду цільовими, а регуляторних – допоміжними.
У межах самих генів у структурному відношенні можна виділити такі складові:
1. Кодуюча частина, де зашифрована інформація про білки – область екзонів.
2. Великі численні області, розташовані між генами, більшість яких кодує жоден білок – інтрони, характерні для генів еукаріотичних організмів.
Незважаючи на те, що інтрони не кодують білки, з них також може зчитуватись РНК (non-protein-coding RNA – ncRNA).На прикладі робіт з Caenorhabditis elegans були отримані дані про те, що такі РНК відіграють значну роль у регулюванні експресії генів. Було встановлено, що продуктами гена lin-4 є малі РНК, що не кодують, отримані з інтронів. Вони регулюють експресію гена lin-14, який, своєю чергою, бере участь у регуляції постембріонального розвитку цих тварин [1].
Окрему структурну групу складають регуляторні зони генів, які представлені такими послідовностями ДНК, як промотори, енхансери, сайленсери та інсулятори.
Існують ще спеціальні мобільні елементи геному, властиві як прокаріотам, так і еукаріотам - транспозони. Наявність транспозонів від початку розцінювали як паразитизм [2], оскільки у стані активності вони здатні поширювати свої копії по геному, розривати гени, що кодують білки, призводити до різних мутацій і порушень у роботі генів [3]. У зв'язку з такою загрозою клітина має захищати геном від наслідків активності транспозонів. Існує кілька таких механізмів захисту, але дослідження останніх років показали, що основним із них є РНК-інтерференція (RNAi), у ході якої за допомогою малих РНК пригнічується експресія мобільних елементів [4]. Однак у поодиноких випадках активність транспозонів може викликати й корисні мутації, граючи значної ролі в еволюційному процесі [5].
Просторова організація ДНК
Для пояснення процесів, пов'язаних із функціонуванням геному, необхідно розглянути організацію ДНК у просторі.
Відомо, що ДНК разом із спеціальними білками утворює комплекс, відомий як хроматин, який, у свою чергу, має кілька рівнів просторової організації, завдяки чому ДНК компактно укладається в ядрі.Від такої організації хроматину залежить наявність доступу до генетичної інформації.
В 1974 [6] стало відомо, що хроматин містить у своєму складі білки - гістони: H1, H2A, H2B, H3 і H4. По дві копії H2A, H2B, H3 і H4 (корових гістонів) утворюють основу – октамер, навколо якої обертається ділянка ДНК довжиною 145–147 пн, і ця структура – нуклеосома – становить близько 10 нм у діаметрі [7; 8].
ДНК здатна також взаємодіяти зі спеціальними негістоновими білками, подібними до будови з гістонами, і з варіантними формами гістонів, що впливають на ступінь активності генів [9].
У зв'язку з певною різноманітністю білків, що входять до складу корових частинок, нуклеосоми не однакові за складом. Слід зазначити, що прикріплення нитки ДНК до октамеру не залежить від конкретних азотистих основ, оскільки гістони взаємодіють з фосфодіефірним кістяком і залишками рибози [9]. Між сусідніми нуклеосомами знаходиться ділянка ДНК - лінкер, довжина якого становить 10-90 пн, залежно від виду організму, типу клітин та ділянок геному. Ще один гістон – Н1 відрізняється за розміром та структурою від корових, зв'язується з лінкером та відіграє важливу роль у підтримці нуклеосомної структури хроматину [8].
До недавнього часу вважали, що другим рівнем упаковки ДНК є компактніше покладені нуклеосомні нитки, що мають діаметр 30 нм [9], однак були отримані дані, що свідчать про те, що це не так і основна одиниця - все-таки нуклеосомна нитка діаметром 10 нм [8]. Регуляція експресії генів може здійснюватися вже на цьому рівні за допомогою компактності хроматину.
Таким чином, ДНК упакована не рівномірно, а з присутністю ділянок більшої та меншої концентрації.Щільно упаковані ділянки називають гетерохроматином, і тут транскрипція неактивна, а більш розріджено упаковані – еухроматином, де розташована транскрипційно-активна ДНК [10].
На наступному рівні упаковки нуклеосомна нитка, або фібрила, укладається в петлі, багато разів скорочуючи місце, що займає, і утворюючи спеціалізовані домени.
Незважаючи на те, що дані про утворення таких петель були представлені ще в минулому столітті [11], секрет процесу петлеутворення було відкрито лише у 2015 році. командою вчених із різних інститутів [12]. Виходячи з отриманих даних, найважливішу роль у цьому процесі грає білок CTCF: 2 його молекули опускаються на нитку ДНК, яка починає простягатися через них так, що процес нагадує припасування лямок рюкзака. Процес триває доти, доки білок не досягне особливої ділянки зв'язування, яка спрацює як сигнал зупинки.
Такі петлі, збираючись, утворюють спеціалізовані домени, а багатоступінчаста технологія упаковки ДНК необхідна не тільки мінімізації займаного простору, але й забезпечення роботи регуляторних механізмів.
Регуляторні елементи генів
Як було встановлено, далеко не всі ділянки ДНК кодують білки. Для позначення таких ділянок був запропонований спеціальний термін "junk DNA", що в перекладі означає "сміттєва ДНК". На початку ХХ століття було здійснено низку відкриттів, які показали, що ці ділянки зовсім не марні, як здавалося раніше. Ці послідовності несуть у собі приховану інформацію, завдяки якій відбуваються процеси, що забезпечують функціонування різних клітин, а зміни, що відбуваються в цих зонах, спричиняють виникнення та розвиток деяких захворювань.Було експериментально встановлено, що ДНК, що не кодує, впливає на регуляцію експресії генів, синтезу білків, може виступати в ролі енхансерів і сайленсерів для різних генів. При цьому один ген може керуватись кількома регуляторними ділянками [13]. Крім цього, з регуляторними ділянками мають здатність зв'язуватися транскрипційні чинники – специфічні білки, які контролюють процес синтезу РНК, тобто. транскрипцію, посилюючи чи послаблюючи її.
Таким чином, щоб забезпечити функціонування генів та контроль їхньої роботи, необхідні спеціальні структури, які діють залежно від потреб живої істоти, чиє життя залежить від цих генів. Регуляторні ділянки також мають свою унікальну структуру, кожна така зона включає особливі елементи.
Серед регуляторних елементів виділяють промотори, віддалені регуляторні елементи, а також «архітектурні» елементи.
Промоторами називають області ДНК, з яких починається транскрипція, що здійснюється за допомогою полімерази РНК, яка дізнається промотор як сигнал до старту транскрипції. За зчитування генів еукаріотів, що кодують білки, відповідає РНК-полімераза II. У цілому нині у будові промоторів можна назвати такі елементи [14]:
1. ТАТА-бокс - специфічна послідовність нуклеотидів, що орієнтує РНК-полімеразу у еукаріотів; у прокаріотів ту ж функцію виконує бокс Прибнова.
2. Inr – Initiator – ініціатор.
3. BREu – upstream TFIIB recognition element – попередній TATA-боксу ділянку зв'язування TFIIB.
4. BREd – downstream TFIIB recognition element – наступний за TATA-боксом ділянку зв'язування TFIIB.
5. Нижній промоторний елемент – downstream promoter element DPE та деякі інші мотиви нуклеотидної послідовності.
До складу різних промоторів можуть входити різні елементи. Ці елементи функціонують за наступною моделлю. Для початку транскрипції з ТАТА-боксом зв'язується спеціальний білок TBP – TATA-Binding Protein [14; 15]. Навколо нього згодом і збираються необхідні тут транскрипційні фактори TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIF, TFIIE і TFIIH і туди направляється РНК-полімераза для початку транскрипції [16]. Складання цього складного комплексу здійснюється в Inr-елементі. Однак не всі промотори містять ТАТА-бокс, і такі промотори знаходяться в CpG-острівцях - це короткі послідовності діною 500-1000 тпн, GC-багаті, у яких співвідношення СpG-і GpC-нуклеотидних пар близьке до одиниці [15]. Промотори можна відстежити в послідовності ДНК за особливими ознаками: більшість з них містять ділянку без нуклеосом або нуклеосома нестабільна і включає такі варіантні гістони, як H2A.Z та H3.3 [17].
Видалені регуляторні елементи здатні контролювати процес транскрипції. До таких елементів відносять енхансери та сайленсери. Енхансерами називають регуляторні послідовності, які активують транскрипцію. При цьому вони здатні функціонувати, перебуваючи в різній орієнтації: цис- або транс-і на значній відстані щодо промотора – до сотень тисяч пар нуклеотидів [18]. Таким чином, у зоні дії енхансерів виявляються не тільки цільові, а й інші промотори, в зоні яких вплив енхансерів обмежують інсулятори.
Механізм такої «розбірливості» енхансерів щодо промоторів досі не зрозумілий, але, ймовірно, тут задіяні особливі білок-білкові взаємодії між компонентами цих регуляторних елементів [15].
Дослідження також показали, що більшість енхансерів еукаріотів виявляє тканинну специфічність [19], яка визначається індивідуальним набором ділянок зв'язування транскрипційних факторів, з яких і складаються енхансери. Сам механізм дії енхансерів вивчений недостатньо повно. Щодо його дії є різні точки зору: наприклад, що енхансери можуть залучати в область промоторів транскрипційні тканини специфічні фактори і додаткові компоненти, що впливають на конфігурацію хроматину; збирати на собі преініціаторний комплекс та доставляти його на промотор, а також стабілізувати цей комплекс. Всі ці моделі передбачають регулювання складання преініціаторного комплексу [15].
Є також припущення у тому, що стадією, підконтрольної энхансерам, не збірка комплексу, а процес від'єднання РНК-полимеразы від промотора, тобто. перехід до стадії елонгації [20]. Також було встановлено, що на енхансерах синтезуються особливі транскрипти, названі енхансерними РНК - eRNA, які також мають здатність посилювати активність промотору [21; 22]. Показано, що роботу одного гена або кількох функціонально пов'язаних можуть контролювати кілька енхансерів. Існує думка про те, що такі енхансери та залежні промотори об'єднані у спеціалізовані активаторні хроматинові блоки – active chromatin hub [23]. У роботі Гаврилова та ін. [24] представлені дані, виходячи з яких слід, такі структури є динамічними, тобто. окремі регуляторні елементи можуть входити до складу кількох блоків, тому повинні перемикатися для роботи в одній з них. Такі блоки допомагають утворювати білок CTCF [25].
У свою чергу завдяки сайленсерам знижується активність транскрипції генів, за рахунок складання на них білкових комплексів, що пригнічують експресію, тому вважається, що це регуляторний елемент, протилежний по дії енхансерам. Так, до цієї групи включають PRE, які є ділянками зв'язування білків групи Polycomb, що пригнічують активність сусідніх генів. Причому, за результатами досліджень Швартца та інших. [26], вони здатні повністю сайленсувати транскрипцію, а й працювати більш тонкому рівні регуляції активності генів. Такі білки утворюють складні комплекси, які пакують хроматин до стану, недоступного для транскрипції [27–29], тобто. механізми їх дії від енхансерів, т.к. сайленсери працюють із конфігурацією хроматину [15]. З'явилися дані про те, що функції сайленсерів менш однозначні, зокрема було показано, що білки групи PcG, а саме RING1, необхідні для забезпечення енхансер-промоторних взаємодій за допомогою реорганізації хроматину, результатом чого стає активація транскрипції [30].
Існує ще третя група регуляторних елементів – архітектурні елементи. Їх завдання полягає у підтримці та регулюванні контактів між ділянками ДНК. Найбільш вивчені з цієї групи такі елементи, як інсулятори, що регулюють взаємодії між енхансерами та промоторами. Їх прийнято розділяти на дві категорії відповідно до специфіки їх роботи. Так, виділяють інсулятори, які здатні блокувати взаємодію між енхансером і промотором, якщо розташовані між ними, та інсулятори, які захищають трансгени від поширення гетерохроматину, що пригнічує активність сусідніх ділянок.Як саме здійснюються ці функції, досі не зрозуміло.
Завдяки аналізу наявних даних [25] стає зрозуміло, що основна частина інсуляторів хребетних CTCF-залежна. З механізму утворення петель з допомогою даного білка, ймовірно, інсулятори здатні регулювати активність генів з допомогою просторової організації ДНК. Істотну роль цьому також грає і когезин – білок, відомий своєю роллю при зближенні сестринських хроматид, тому можна припустити, що він також бере участь у встановленні контактів між частинами різних петель у межах однієї хромосоми [31]. У місці локалізації інсуляторів утворюються активні хроматинові домени, що відрізняються особливим поєднанням варіантних гістонів [15].
Усі розглянуті механізми регуляції експресії генів життєво необхідні всім організмів, особливо у етапі диференціювання клітин у многоклеточных. У складно влаштованих живих організмах при ідентичному наборі хромосом і генетичному коді спостерігається безліч типів клітин, які проходять процес диференціювання на певному етапі розвитку. Так, у D. melanogaster комплекс гомеозисних генів Bithorax (BX-C) відповідає за розвиток сегментів задніх двох третин тіла мушки, що здійснюється за участю різних регуляторних елементів. ВХ-С містить лише 3 гени, проте визначають вони 14 парасегментів зародка [32-35].У міру вивчення даного питання та накопичення знань у галузі регуляції експресії генів, було встановлено наявність у BX-C особливих морфогенів, контрольованих материнським геномом, енхансерних та сайленсерних послідовностей, які контролювали ступінь активності генів у кожному конкретному сегменті, а білки, що кодуються гомеозними генами. своєю чергою, впливають індивідуальне розвиток сегментів. Для такої регуляції призначені гени груп Pоlycomb і Thrithorax: перші підтримують неактивний стан генів, а другі діють на противагу, посилюючи експресію [36-39]. Вони пов'язуються з особливими послідовностями – PRE та TRE. Вважається, що для забезпечення взаємодій різних регуляторних елементів із цільовими генами BX-C розбитий на регуляторні домени, розділені інсуляторами. Таким чином, концентрація морфогенів впливає на активацію тих чи інших сегментаційних генів, що дає інформацію про активність домену [40].
У процесі диференціювання клітин ключову роль грає механізм епігенетичної пам'яті – регулювання наступного порядку [8].
Епігенетична регуляція геному
Довгий час вважалося, що лише гени, тобто. певні ділянки ДНК (а в деяких вірусів – РНК) визначають фізіологію та диференціювання клітин, а отже – будову та розвиток всього організму. Однак, починаючи приблизно з середини ХХ століття, вчені всього світу поступово дійшли висновку, що існують механізми, що працюють на рівні, що знаходиться над генами. Чинники, які контролюють активність генів, але при цьому не впливають на послідовність нуклеотидів, на відміну від мутаційних змін, назвали епігенетичними. Так, вже 1958 р.Девід Ненні вказував на труднощі з розумінням кордону між регуляцією за допомогою ДНК та епігенетичною регуляцією внаслідок успадковуваності епігенетичних ознак. Як було встановлено, гени, безперечно, є основою геному, але становлять лише його частину, тому в генетиці з'явився важливий розділ, що займається спадковістю, не пов'язаною з послідовністю ДНК, – епігенетика.
Прикладом прояву епігенетичного регулювання роботи генів вважають зміну їх активності. Деякі їх, найважливіші у життєдіяльності організму, можуть «працювати», тобто. перебувати в активному стані протягом усього життя. Однак інші, чиї функції необхідні лише, наприклад, в екстремальних ситуаціях, активуються за певного зовнішнього впливу. Іноді відбуваються збої у роботі цієї системи, а інформація про зміну генетичної активності фіксується, запам'ятовується та передається нащадкам. Гени у своїй залишаються у колишньому складі, тобто. мутації немає, проте регуляція експресії гена стає інший, змінюючи кінцевий результат. Таким чином, епігенетична регуляція дозволяє змінювати функціонування певних генів у відповідь на дію різних факторів [41]. Як основні види епігенетичних механізмів називають модифікації гістонів, метилювання ДНК і РНК, що не кодують, з яких найбільш добре вивчені перші два.
Модифікації гістонів – це зміна амінокислотних залишків (метилювання, ацетилювання, фосфорилювання), що входять до конкретного гістону [42].Прикладом може бути досить добре вивчений варіантний гістон Н2А.Z, що впливає на формування активного/неактивного хроматину [43], ДНК метилювання піддається цитозин [44]. Обидва ці процеси визначають ступінь щільності упаковки ДНК, що впливає на активність генів. Некодуючі РНК потрібні організмам, т.к. вони беруть участь у розвитку та експресії генів, проте деякі з них є причиною захворювань. Певні некодуючі РНК функціонують як онкогени, є маркерами та мішенями при лікуванні деяких захворювань [45; 46].
Епіген відрізняється в кожному типі клітин, що дозволяє їм відрізнятися один від одного. У кожній клітині регуляція експресії генів здійснюється по-своєму: на рівні організації ДНК, щільності упаковки і т.д., зберігаючи інформацію про попередні транскрипції [47]. Докази успадкованості епігенетичних ознак були отримані ще в 1998 році, коли встановили, що області перекриття PRE і TRE у складі ВХ-С здатні епігенетично регулювати експресію генів у ході розподілу [48]. Також були знайдені зв'язки між епігенетичною пам'яттю та виникненням ожиріння на прикладі мишей [49], а також процесами старіння [50].
Отже, у процесі тривалих генетичних досліджень було визначено, що геном – основний визначальний чинник життя живих організмів. Крім того, пристрій генів, структурні або регуляторні гени, універсально.
Упаковка хроматину впливає наявність доступу до генетичної інформації, тобто. ступінь її експресії, а утворення петель регулює роботу геному за допомогою створення спеціалізованих доменів та забезпечує роботу регуляторних механізмів.Провідну роль у цьому грає білок CTCF, який задіяний ще й у освіті активних хроматинових блоків і впливає на діяльність інсуляторів.
Такі структурні елементи генів, як промотори, енхансери, сайленсери, інсулятори разом складають взаємопов'язану і взаємозалежну регуляторну систему. Було встановлено, що роль сайленсерів є неоднозначною і окремі представники цієї групи регуляторних елементів здатні активувати транскрипцію.
На прикладі D. melanogaster показана життєва необхідність організму у правильній регуляції роботи геному, особливо на стадії диференціювання клітин. Було з'ясовано, значна частина регуляції забезпечується системою вищого порядку – эпигенетической.
Таким чином, без точних знань структури, функцій та принципів роботи елементів, що регулюють експресію генів, неможливо створювати штучні функціонуючі гени, попереджати та лікувати недуги, пов'язані з порушенням діяльності геному. Крім того, епігенетичні особливості геному можуть бути маркерами при діагностиці різних захворювань.
