Реплікація
Білки та ферменти, що беруть участь у реплікації ДНК
ДНК-полімерази здійснюють синтез ДНК. Субстратом цих ферментів є дНТФ: дАТФ, дГТФ, дЦТФ і дТТФ. Рівняння реакції, що каталізується ДНК-полімеразами, у загальному вигляді виглядає так:
ДНК-полімерази послідовно додають нуклеотиди до 3'-кінця полінуклеотидного ланцюга:
Синтез нового ланцюга відбувається у напрямку від 5'-кінця до 3'-кінця.
ДНК-полімераза може тільки нарощувати ланцюг ДНК, почати синтез ДНК з нуля вона не в змозі, для початку її роботи потрібно затравка. Як затравка може виступати фрагмент ДНК або РНК (рис. 2.1). ДНК-полимераза здатна подовжувати ланцюг також у присутності ланцюга, що грає роль матриці (рис. 2.1). Нуклеотиди приєднуються до затравки відповідно до принципу комплементарності, навпроти аденіну завжди буде вбудовується тімін, а навпроти гуаніну – цитозин (рис. 2.1).
Рис.2.1. ДНК-полімераза нарощує ланцюг у напрямку 5'→3'.
Для цього їй потрібні матриця та затравка.
ДНК-полимеразы здатні копіювати будь-яку ланцюг ДНК, тобто. вони не специфічні до послідовності нуклеотидів матриці. Швидкість ДНК-полімеразної реакції коливається в межах від 50 нуклеотидів за секунду у еукаріотів до 500 нуклеотидів за секунду у прокаріотів.
Головним завданням ДНК-полімераз є зняття точної копії з матриці, у зв'язку з цим вони перевіряють комплементарність кожного нуклеотиду двічі: перед включенням його до складу ланцюга, що росте, і перед тим як включити наступний нуклеотид. Черговий фосфодіефірний зв'язок утворюється, якщо останній нуклеотид комплементарний матриці.Якщо включений некомплементарний нуклеотид, він видаляється за рахунок 3 → 5'-экзонуклеазной активності ДНК-полимеразы, і лише після видалення некомплементарного нуклеотиду ДНК-полимераза продовжить нарощувати ланцюг ДНК (рис.2.2).
Рис.2.2. ДНК-полімераза видаляє некомплементарний нуклеотид і потім продовжує синтез ДНК
Праймаза каталізує матричний синтез короткої РНК-затравки (праймера) у напрямку 5'→3'. Праймер використовує ДНК-полімеразу для ініціації синтезу ДНК (рис. 2.3).
Мал. 2.3. Праймаза синтезує РНК-затравку, яку ДНК-полімераза використовує для синтезу ДНК
ДНК-лігаза з'єднує 5'-фосфатну та 3'-гідроксильну групи сусідніх нуклеотидів, в результаті утворюється фосфодіефірний зв'язок, що ліквідує розрив (рис. 2.4).
Рис.2.4. ДНК-лігаза поєднує розрив
ДНК-хеліказ здійснює розплетення подвійної спіралі ДНК, використовуючи енергію гідролізу АТФ. В результаті її дії виникає «вилка» (Y), що складається з дволанцюгової ділянки ДНК та двох одноланцюгових гілок (рис. 2.5.).
Білки, що зв'язуються з одноланцюговою ДНК (SSB-білки), мають велику спорідненість до одноланцюгової ДНК, перешкоджають утворенню подвійної спіралі (рис. 2.5.). Топоізомерази знімають напруги, що виникає в результаті розплетення подвійної спіралі в ДНК, за рахунок розриву та подальшого возз'єднання ланцюга ДНК (рис. 2.5).
Мал. 2.5. Роль ДНК-хелікази, SSB-білків, топоізомерази
Біологічна бібліотека – матеріали для студентів, вчителів, учнів та їх батьків.
Наш сайт не претендує на авторство розміщених матеріалів. Ми лише конвертуємо у зручний формат матеріали, які знаходяться у відкритому доступі та надіслані нашими відвідувачами.
Якщо ви володієте авторським правом на будь-який розміщений у нас матеріал і маєте намір видалити його або отримати посилання на місце комерційного розміщення матеріалів, зверніться для погодження до адміністратора сайту.
Дозволяється копіювати матеріали з обов'язковим гіпертекстовим посиланням на сайт, будьте вдячними ми витратили багато зусиль, щоб привести інформацію у зручний вигляд.
Cell Biology.ru
Основні результати реплікації отримані на модельній системі з ДНК вірусу SV40, в якій процес реплікації досліджували в заражених клітинах людини, що культивуються in vitro. У цій системі вірусний білок, званий Т-антигеном, виконує багато функцій, необхідних реплікації вірусної ДНК. По-перше, він є білком-ініціатором, необхідним для ініціації реплікації; по-друге, він має ДНК-геліказну активність, тобто. розплітає ланцюга ДНК, що реплікується перед працюючою ДНК-полімеразою, і, по-третє, Т-антиген необхідний для правильної взаємодії з ДНК ферментного комплексу, що синтезує праймери (праймосоми). Тим не менш, вірус SV40 використовує для реплікації ДНК своєї невеликої хромосоми та багато білків клітини-господаря, що дозволяє досліджувати функціонування реплікативного комплексу клітин людини в такій відносно простій системі.
У еукаріотів виявлено шість ДНК-полімераз, три з яких – α, δ і ε – безпосередньо беруть участь у реплікації хромосомної ДНК. Амінокислотні послідовності цих трьох ферментів гомологічні один одному та послідовності продукту гена 43 бактеріофага Т4.
Еукаріотична ДНК-праймаза на відміну від аналогічного білка прокаріотів утворює постійний комплекс з ДНК-полімеразою α, роль якого, мабуть, обмежується синтезом праймерів при реплікації обох ланцюгів ДНК.
Білок PCNA та фактор реплікації C (RFС) також утворюють стабільний комплекс із ДНК-полімеразою δ, а в певних умовах стимулюють і активність ДНК-полімерази ε. У багатьох відношеннях PCNA і RFС є функціональними аналогами відповідно β-білка та білків γ-комплексу E. coli, і їхня роль у синтезі провідного та відстаючого ланцюгів ДНК вірусу SV40 добре відома.
Механізми реплікації ДНК прокаріотів і еукаріотів істотно різняться в тому відношенні, що в другому випадку синтез провідної і відстаючої ланцюгів ДНК здійснюють різні ДНК-полімерази (α і δ відповідно), тоді як у E. coli обидва ланцюга ДНК синтезуються димером ДНК-полімерази III. ДНК-полімераза проводить ініціацію синтезу провідного ланцюга в точках початку реплікації, а ДНК-полімераза здійснює циклічні реініціації синтезу фрагментів. реініціації синтезу наступного фрагмента Козаки. Дозрівання фрагментів Оказаки у еукаріотів вимагає видалення РНК-затравок за допомогою 5'→3'-екзонуклеази (білкові фактори FEN-1 або MF-1) і РНКази H1, а також ковалентної сполуки фрагментів один з одним під дією ДНК-лігази I. Роль ДНК-полімерази в даний час не зрозуміла. Можливо, цей фермент бере участь безпосередньо в реплікації або в поєднаній з реплікацією репарації пошкоджень ДНК, а також в регуляції клітинного циклу. ДНК-полімераза ζ виявлена 1996 р. у дріжджів S. cerevisiae.При дослідженні білків Rev3 і Rev7, які необхідні для мутагенезу, що індукується у відповідь на пошкодження ДНК, виявилося, що їх комплекс має ДНК-полімеразну активність. полімерази становить лише 1% від активності ДНК-полімерази ζ. η, так само як і попередній фермент, бере участь у SOS-відповіді дріжджів на генотоксичні впливи.
Оскільки ДНК-полімерази ссавців позбавлені 3'-5'- та 5'-3'-екзонуклеазних активностей, властивих ферментам Е. coli, залишається незрозуміло, як у процесі реплікації ДНК у цих організмів видаляються випадково включені помилкові нуклеотиди та РНК-затравки фрагментів. .
Синтез лідируючого та відстаючого ланцюга здійснюють різні дНК-полімерази (альфа, дельта), тоді як у E. coli обидва ланцюги ДНК синтезуються димером ДНК-полімерази III.
ДНК-полімераза проводить ініціацію синтезу провідного ланцюга в точках початку реплікації, а ДНК-полімераза здійснює циклічні реініціації синтезу фрагментів. реініціації синтезу наступного фрагмента
Дозрівання фрагментів Оказаки у еукаріотів вимагає видалення РНК-затравок за допомогою 5'>3'-екзонуклеази (білкові фактори FEN-1 або MF-1) і РНКази H1, а також ковалентного з'єднання фрагментів один з одним під дією ДНК-лігази I .
ДНК-полімераза виявлена в 1996 р.у дріжджів S. cerevisiae. При дослідженні білків Rev3 і Rev7, які необхідні для мутагенезу, що індукується у відповідь на пошкодження ДНК, виявилося, що їх комплекс має ДНК-полімеразну активність. Ця полімераза здатна ефективно використовувати як матрицю ДНК, що містить циклобутанові димери. У таких умовах активність ДНК-полімерази? становить лише 1% від активності ДНК-полімерази?. ДНК-полімераза?, так само як і попередній фермент, бере участь у SOS-відповіді дріжджів на генотоксичні дії. У присутності всіх чотирьох дезоксирибонуклеозидтрифосфатів вона здійснює включення в ланцюг ДНК, що будується, навпроти тімінових димерів тільки правильних нуклеотидів (А).
Крапки початку реплікації
Ori - AT-багаті, легкоплавкі ділянки довжиною ~200 пн, розташовані, як правило, між генами в промоторних областях.
Не всі ori реплікуються в одному клітинному циклі.
Ориджини реплікації можуть розташовуватися всередині кодуючої частини генів, наприклад в гені (betta-глобіні курчати знаходиться принаймні чотири ориджини реплікації, причому було показано що активність генів не пов'язана зі ступенем реплікації. На вибір ориджинів реплікації впливає ацетилювання гістонів, хоча , реплікація в В бета-глобиновому локусі курка не чутлива ні до ацетилювання ні до деацетилювання гістонів.
Ініціація реплікації
Ініціація реплікації у еукаріотів відбувається на специфічних множинних послідовностях нуклеотидів – реплікаторах. Найбільш вивченими є реплікатори дріжджів S.cerevisiae, вперше ідентифіковані як послідовності, що автономно реплікуються (ARS – autonomously replicating sequence), здатні підтримувати позахромосомну реплікацію плазмід у дріжджових клітинах. Дослідження структури ARS1 показало, що цей хромосомний елемент складається з кількох коротких послідовностей регуляторних. Аналогічна організація й у інших ARS дріжджів. Зокрема, ARS307 на додаток до канонічної послідовності ACS, загальної всім ARS, містять ще два елементи – B1 і B2, які необхідні виконання реплікатором своїх функцій in vivo. Незважаючи на те, що ці послідовності в різних реплікаторах не суворо консервативні, всередині груп (B1, B2 і т.п.) вони функціонально взаємозамінні. Зміна положення щодо ACS запобігає їхньому функціонуванню.
Першим етапом ініціації реплікації у дріжджів є взаємодія регуляторних послідовностей реплікатора, принаймні з шістьма різними білками, які утворюють комплекс, що розпізнає область початку реплікації ORС (origin-recognition complex). ARS визначає місце ініціації реплікації у клітинах дріжджів. Елемент B3 ARS1 взаємодіє з білком Abf1, який стимулює реплікацію доменом, притаманним білків-активаторів транскрипції, тоді як B1 взаємодіє з ORC. Регуляторні послідовності області початку реплікації дріжджів утворюють раніше невідомий елемент,
названий ДНК-розплутуючим елементом DUE (DNA-unwinding element), який, як вважають, полегшує розкручування ланцюгів ДНК при ініціації реплікації.Точкові мутації в елементі B2 не впливають на функції реплікатора, що є загальною властивістю структурних елементів, тоді як мутації ACS, B1 і B3 порушують ініціацію реплікації, як і слід очікувати від регуляторних елементів нуклеїнових кислот, що взаємодіють з білками.
Дослідження реплікаторів у дріжджів S. pombe показали, що область початку реплікації ura4 включає три окремих реплікатора, які розташовуються на ділянці ДНК довжиною в 5 тпн. У ссавців області початку реплікації розташовуються з відривом ~100 тпн друг від друга. Синтез ДНК в окремих репліконах відбувається за двома напрямками, причому переміщення реплікативної вилки здійснюється переважно в одному напрямку, яке може змінюватись в залежності від стадії розвитку організму та рівня експресії генів, що містять реплікатори. Частота використання окремих реплікаторів
змінюється в онтогенезі, зменшуючись у клітинах дорослого організму. Порівняння первинних структур шести окремих реплікаторів еукаріотів показало, що всі вони містять DUE-елементи, ділянки прикріплення до ядерного матрикса (SAR/MAR), канонічні ARS-послідовності дріжджів, піримідинові тракти, а також раніше неідентифіковану канонічну послідовність WAWTTDDWWW T, D = A/C/T, H = A/C/T, M = A/C. Є окремі повідомлення про те, що в реплікаторах тварин присутні пуринові тракти, канонічні послідовності, що взаємодіють з факторами транскрипції та
білками реплікативного комплексу, енхансерний октамерний мотив, сайти зв'язування продуктів онкогенів, AT-багаті послідовності та ділянки перегинів (bent) ДНК.Нині остаточно незрозуміло, яке безпосереднє відношення мають ці регуляторні послідовності до ініціації реплікації ДНК. Передбачається, що багато з них беруть участь у регуляції транскрипції (а отже, і регуляції експресії генів) як такої, оскільки більшість з відомих у
Нині реплікаторів локалізовані в 5'-кінцевих послідовностях функціонуючих генів.
Елонгація реплікації
Термінація реплікації
Реплікація тіломірних районів хромосом
Синтез теломірних послідовностей ДНК здійснюється спеціальними ферментами – теломеразами. Особливістю цих ферментів є присутність у них як складова частина короткого фрагмента РНК – компонента, що служить матрицею при синтезі теломерних послідовностей хромосом. Комплементарна взаємодія внутрішньої РНК теломерази з 3'-кінцевим виступаючим одноланцюжковим сегментом ДНК хромосоми ініціює синтез теломірних послідовностей. При цьому 3'-кінцевий фрагмент ДНК служить затравкою для подовження цієї ДНК на РНК-матриці. Після подовження (елонгації) виступаючого ланцюга ДНК до кінця матриці відбувається транслокація ферменту на один теломерний повтор вперед щодо матриці зі звільненням послідовності матричних нуклеотидів, після чого він готовий для вступу в наступний цикл елонгації щойно доданої 3'-кінцевої послідовності хромосоми. Після завершення подовження одноланцюгової 3'-кінцевої послідовності теломерной другий ланцюг ДНК добудовується звичайним способом. Таким чином відбувається вирішення "проблеми відстаючого ланцюга ДНК" при реплікації ДНК у еукаріотів.Наявність у тварин тканиноспецифічності у розподілі теломер за розмірами, а також зміна розмірів цих послідовностей в онтогенезі передбачають існування механізмів, що регулюють цей процес. Складається враження, що для активної проліферації клітин тіломірні послідовності не повинні ставати коротшими за певний пороговий розмір. Нещодавні дослідження виявили різке підвищення активності теломеразу, характерне для пухлинних клітин, що слугує нині чутливим фізіологічним маркером їх злоякісного переродження. У зв'язку з цим сьогодні як один із підходів до терапії пухлин розглядають придушення активності теломераз, функціонування яких, як вважають, необхідне для імморталізації клітин та зростання пухлин. Саме завдяки таким властивостям теломерази останнім часом викликають особливий інтерес, що супроводжується розширенням досліджень у цій галузі молекулярної генетики.
Регулювання реплікації
Просторова організація реплікації
У ядрах ссавців при реплікації виявляється близько 150 центрів реплікації - реплікативні фабрики або реплісоми, які приблизно рівномірно віддалені один від одного. Під час ініціації синтезу ДНК розмір цих центрів малий, і вони виявляються у вигляді невеликих чітко окреслених "крапок", які з часом стають більш дифузними. У цих центрах реплікації відбувається акумуляція білків, що беруть участь у синтезі ДНК: ДНК-полімерази, PCNA та RP-A, а також регуляторних молекул типу цикліну А, cdk2 та RPA70.
Імунохімічними методами з використанням частинок колоїдного золота було показано, що ланцюги ДНК, що ростуть, виходять з центрів реплікації.Це дозволяє припускати, що під час реплікативного синтезу ланцюга ДНК переміщуються через фіксовані всередині ядра структури реплікаційного апарату. Така внутрішньоядерна компартменталізація синтезу ДНК дозволяє концентрувати регуляторні, структурні та ферментативні компоненти, що беруть участь у реплікації та підтримці просторової структури хромосом. Ступінчасте складання функціонально активних елонгуючих комплексів у мікрокомпартментах ядра надає великі можливості для регулювання ініціації реплікативного синтезу ДНК.
Роль ядерних просторових структур у забезпеченні функціональних властивостей ДНК можна розглянути на прикладі реплікації
хромосом в ооцитах Xenopus laevis Ін'єкція прокаріотичної ДНК в ооцити або її додавання до екстрактів ооцитів супроводжується утворенням псевдоядер, компетентних щодо реплікації ДНК. Реплікація у таких системах просторово упорядкована: вона відбувається у дискретних ділянках ДНК, які містять кластери реплікативних виделок. При цьому спостерігається чудова кореляція між числом і просторовим розподілом центрів реплікації в штучних псевдоядрах і ядрах клітин, що культивуються, що знаходяться в S-фазі. Отже, складання функціонуючих комплексів, здатних ініціювати реплікацію, не залежить від послідовностей нуклеотидів ДНК хромосом, але великою мірою залежить від внутрішньої просторової структури ядра і може ефективно відбуватися навіть на прокаріотичних ДНК. Це означає, що просторова структура ядра може безпосередньо контролювати його функції, у разі – ініціацію реплікації хромосом.Слід, проте, пам'ятати, що у ранніх ембріональних стадіях розвитку Xenopus контроль реплікації ослаблений, і число зон початку реплікації значно більше, ніж у соматичних клітинах. Нормальний контроль реплікації встановлюється після збільшення тривалості клітинного циклу на стадії середньої бластули. У нормальних соматичних клітинах в повному обсязі центри реплікації одночасно починають синтез ДНК. Деякі з них функціонують у ранній, а деякі в пізній S-фазі клітинного циклу. Така диференціальна реплікація хромосом є важливим регуляторним механізмом, що забезпечує локальну організацію хроматину та активність генів. Аналогічне явище виявлено у клітинах дріжджів, де функціонування у часі центрів реплікації залежить від положення хромосом у ядрі.
P. Norio DNA repplication: the unbearable lightness of origins EMBO reports 7, 8, 779–781 (2006)
Білки та ферменти, що беруть участь у реплікації ДНК
Процес реплікації ДНК здійснюється за участю безлічі білків, які утворюють складний та ефективно працюючий реплікативний комплекс.
ДНК-полімерази. Комплементарне копіювання одноланцюгової матриці каталізують ДНК-залежні ДНК-полімерази або просто ДНК-полімерази. Деякі про- та еукаріотичні ДНК-полімерази отримані в чистому вигляді, охарактеризовано їх фізичні та ферментативні властивості. І хоча ці властивості не зовсім ідентичні, механізм їхнього каталізу для всіх зазначених ферментів у загальних рисах однаковий.
Полімеризація нуклеотидів у процесі реплікації відбувається тільки в одному напрямку: від 5'-кінця до З'-кінця (5' -> 3') ланцюга, що будується, і синтезований полінуклеотидний ланцюг ДНК анти- паралельний по відношенню до ДНК-матриці (рис. 7.1 ).
ДНК-полімерази байдужі до послідовності нуклеотидів матриці.ДНК синтезується надзвичайно швидко: швидкість її полімеризації коливається в межах від 50 нуклеотидів/с у еукаріотів до 500 нуклеотидів/с у бактерій.
Нормальне розмноження клітин вимагає високої точності копіювання ДНК-матриці, для чого існують спеціальні механізми, один з яких механізм корекції. ДНК-полімерази перевіряють комплементарність кожного нуклеотиду матриці двічі: один раз перед включенням його до складу зростаючого ланцюга і другий раз перед тим, як включити наступний нуклеотид.
Черговий фосфодіефірний зв'язок у процесі реплікації утворюється лише в тому випадку, якщо останній (З'-кінцевий) нуклеотид синтезованого ланцюга комплементарний матриці. Якщо ж попередньої стадії полімеризації відбулася помилка, то реплікація зупиняється до того часу, поки неправильний нуклеотид буде видалено. Для цього фермент перемішується у зворотному напрямку та вирізає останню додану ланку. Виявилося, що деякі ДНК-полімерази мають поряд з полімеразною також
Мал. 7.7. Схема подвоєння молекули
3'^5'-екзонуклеазною активністю (див. п. 7.2), завдяки якій і відбувається відщеплення не спареного з матрицею нуклеотиду синтезованого ланцюга, після чого полімеризація відновлюється. Внаслідок такого усунення помилок зчитування їх рівень зводиться до мінімуму. Так, частота помилкових включень нуклеотидів у ДНК у кишкової палички не перевищує lO9-1010 на нуклеотид за один раунд реплікації.
ДНК-праймаз. ДНК-полімерази не здатні ініціювати синтез нових ланцюгів ДНК, вони можуть лише додавати дезоксирибонуклеотидні ланки до З'-кінця вже наявного полінуклеотидного ланцюга. Щоб молекули ДНК-полімераз могли почати синтез ДНК, їм необхідна затравка, або праймер (Від англ, primer - Затравка),
молекули ДНК під час реплікації
їм необхідна затравка, або праймер (Від англ, primer - затравка), короткий олігодезоксирибонуклеотид або олігорибонуклеотид, комплементарний відповідній ділянці ДНК-матриці, у якого на кінці є вільна З'-ОН-група. Нездатність молекул ДНК-полімераз самостійно, без затравки починати синтез ДНК принципово відрізняє ці ферменти з інших ферментів матричного синтезу — РНК-полимераз.
На стадії ініціації реплікації коротку РНК-затравку з рибонуклеозидтрифосфатів синтезує фермент, званий ДНК-праймазою. ДНК-праймаза може бути окремим ферментом (як у бактерій) або входити як субодиниця в ДНК-полімеразу (як у ДНК-полімерази а еукаріотів). У будь-якому випадку праймаза - це фермент, відмінний від РНК-полімераз, які синтезують різноманітні клітинні РНК. Після того, як буде синтезовано РНК-праймер, підключається ДНК-полімераза і продовжує нарощувати ланцюг. Новосинтезовані ланцюги ДНК завжди містять на 5'-кінці кілька рибонуклеотидів: у прокаріотів - від двох до п'яти нуклеотидів, у еукаріотів їх вдвічі більше. Надалі короткі праймери замінюються сегментами ДНК.
Оскільки два ланцюги в молекулі ДНК антипаралельні, а ДНК-полімерази здатні нарощувати полінуклеотидний ланцюг тільки в напрямку 5' - 3', один і той же фермент, ДНК-полімераза, не може забезпечити складання дочірніх ланцюгів одночасно в напрямках 5' -> 3 'і 3' -> 5' відповідно до переміщення реплікативної вилки при розплітанні біспіральної молекули ДНК. Напрямок розплітання подвійної спіралі при реплікації збігається з напрямом синтезу ДНК лише для одного матричного ланцюга, в той же час воно протилежне напрямку синтезу ДНК на комплементарній матриці.Це означає, що лише на одному матричному ланцюзі, орієнтованому у напрямку 3' - 5', синтез ДНК може проходити безперервно. На другому матричному ланцюзі, орієнтованому в напрямку 5' -> 3', ДНК синтезується короткими фрагментами (1000-2000 нуклеотидів у прокаріотів і 100-200 нуклеотидів в реплікується ДНК еукаріотів), названими фрагментами Оказаки на честь вченого, що відкрив їх (рис. 7.2).
Мал. 7.2. Синтез ланцюгів ДНК у реплікативній вилці
Напрямок реплікації 5' -> 3'. Один ланцюг (лідируючий) синтезується як єдине ціле, а інший (відстає) — короткими фрагментами (фрагменти Оказаки), які згодом з'єднуються з утворенням безперервного ланцюга
Новостворений ланцюг, який синтезується безперервно, отримав назву провідною, або лідируючою, а інша, що збирається з фрагментів Оказаки, веденою, або відстає. Синтез кожного із цих фрагментів починається з РНК-затравки. Такий механізм реплікації називається уривчастим (або напівбезперервним). Ведучий ланцюг потребує лише одного акта ініціації, а синтезу відстаючої ланцюга має відбутися кілька актів ініціації. Через деякий час РНК-затравки (праймери) видаляються, проломи «забудовуються» ДНК-полімеразою і фрагменти зшиваються спеціальним ферментом ДНК-лігазом в один безперервний ланцюг, що відстає.
ДНК-лігаза. ДНК-лігази вірусів, бактерій, ссавців з'єднують 5'-фосфатну та З'-гідроксильну групи нуклеотидів, що знаходяться на протилежних кінцях одноланцюгового розриву в дуплексі ДНК. В результаті утворюється фосфодіефірний зв'язок, що ліквідує цей розрив (рис. 7.3).
Мал. 7.3. Механізм дії ДНК-лігази:
Риб - рибоза; А - аденін; РР - пірофосфат
ДНК-лігаза е. coli - Це одиночний поліпептид (мол. маса 75 000 Так).
Для утворення фосфодіефірного зв'язку між кінцями нуклеотидних ланцюгів ДНК-лігази застосовують енергію гідролізу АТР чи NAD.
I. Реакція аденілювання ДНК-лігази. Фермент взаємодіє з АТР (ДНК-лігаза фагів та ссавців) або NAD (ДНК-лігаза Е. coli) з утворенням ферменту - аденілатного похідного по e-NH2-rpynne залишку лізину поліпептидного ланцюга з одночасним вивільненням пірофосфату (у разі АТР) або нікотинамідмононуклеотиду (у разі NAD).
ІІ. Реакція трансаденілювання. Залишок аденілової кислоти з аденілатлігази перекидається на вільну фосфатну групу 5'-вуглецевого атома рибози кінцевого нуклеотиду.
ІІІ. Реакція лігування. Між зближеними активованою аденілатом 5'-фосфатною групою та З'-ОН-групою фрагмента ланцюга ДНК відбувається утворення фосфодіефірного зв'язку з виділенням АМР.
ДНК-хеліказу. Нативні ДНК біспіральні. Для здійснення комплементарного копіювання ланцюгів дволанцюжкова ДНК повинна поступово розкручуватися.
Хелікази мають кільцеву (тороїдальну) структуру, утворену шістьма субодиницями. до 4 нм, достатній для взаємодії як з одноланцюгової, так і з дволанцюгової ДНК.
Хеліказа, рухома гідролізом АТР, односпрямовано переміщається по одному з ланцюгів ДНК (ймовірно, за рахунок її конформаційних змін), розплітаючи перед собою подвійну спіраль, внаслідок чого виникає «вилка» (Y) з дволанцюгової ділянки ДНК і двох одноланцюгових гілок ( див. Мал. 7.4).
Хелікази часто функціонують у складі комплексу, що здійснює переміщення реплікативної вилки та реплікацію розплетених ланцюгів.
Білки, що зв'язуються з одноланцюжковою ДНК, або SSB-білки (Single Strand Binding Proteins), мають велику спорідненість з одноланцюгової ДНК незалежно від послідовності підстав і взаємодіють з нею по всій довжині ниток, що розділилися. SSB-білок е. coli є тетрамером (мол. маса 88 000 Так), характеризується високим ступенем асиметрії молекули, переважанням дикарбонових амінокислот над діамінокислотами. Білок кооперативно зв'язується з одноланцюговою ДНК, зберігаючи її у розтягнутому стані. Суть кооперативного способу зв'язування полягає в тому, що зв'язування однієї молекули білка полегшує зв'язування іншої, доки вся одноланцюжкова ДНК не буде покрита білком SSB. Якщо хелікази викликають локальне розкручування подвійної спіралі, SSB-білки стабілізують одноланцюгову ДНК, забезпечуючи умови для комплементарного спарювання. SSB-білки видаляють можливі елементи вторинної структури ДНК; зв'язування одноланцюгової ДНК з SSB-білками стимулює ДНК-полімеразу та підвищує точність її роботи. У еукаріотів таким білком є ядерний реплікативний білок A (RPA), що представляє гетеротример з субодиницями 70, 32-34 і 11-14 кДа.
Мал. 7.4. ДНК-хелікази:
а - четвертинна структура гексамерних ДНК-хеліказ: фага Т4 (I), вірусу SV40 (2), Dna В е. coli (3); б - схема розплетення подвійної спіралі ДНК-хеліказою
Топологічні проблеми реплікації ДНК було розглянуто у темі 3.
Початок реплікації. Молекула ДНК, здатна до автономної реплікації, отримала назву реплікону. Реплікон містить усі необхідні гени та регуляторні послідовності, які забезпечують регульоване подвоєння його ДНК. Ділянка реплікону, в якій починається реплікація, називається реплікатором, або областю початку реплікації (англ. replication origin), у Е. coli — ori З.
При ініціації реплікації ініціатор, кодований репліконом (у Е. coli - Білок Dna А), взаємодіє з реплікатором. Ціла хромосома Е. coli є репліконом; у еукаріотів репліконом називають відрізок ДНК, реплікація якого протікає під контролем єдиної точки початку реплікації. Точка початку реплікації має специфічну послідовність основ, багату на пари А-Т, що, ймовірно, полегшує поділ ланцюгів.
В результаті ініціації раунду реплікації у точці ori утворюється одна або дві вилки реплікативні. При односпрямованій реплікації виникає одна реплікативна вилка (плазміда ColFl), і синтез закінчується у точці ori (рис. 7.5).
Мал. 7.5. Напрямок реплікації:
а - Односпрямована реплікація в кільцевій молекулі ДНК; б - Двонаправлена реплікація в кільцевій молекулі ДНК; в - множинна двонаправлена реплікація в еукаріотичній хромосомі (поліреплікон)
При двонаправленій реплікації (хромосома Е. coli) ініціюються дві реплікативні вилки, що переміщаються в протилежних напрямках доти, доки вони не зустрінуться на протилежному боці кільця.
Для геномів еукаріотів зазвичай характерна наявність множинних точок початку реплікації, розкиданих по хромосомі на відстані 20 тис. н. п. т., е. еукаріотичні хромосоми мають полірепліконну організацію. Після ініціації реплікація триває у двох напрямках від кожної точки доти, доки реплікативні вилки двох сусідніх точок початку реплікації не зіллються. Повнорозмірні ДНК кожної дочірньої хромосоми виходять шляхом з'єднання коротших, незалежно ініційованих новосинтезованих ланцюгів.
